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转Cry1Ab基因抗虫水稻的检测方法研究

【摘要】:转基因技术的广泛影响以及在商业化推广中存在着的潜在风险,决定了相关部门需要对转基因生物及产品进行有效跟踪、监控、风险评估和标识。我国实施了对包括大豆、玉米、棉花、油菜和番茄5类转基因作物以及17种产品的强制性定性标识制度,而快速准确高效的转基因产品检测技术与方法标准是标识制度实施的技术前提,是转基因生物及产品安全评价及管理的基础。本研究以一种转Cry1Ab基因抗虫水稻为试验对象,通过引物初步筛选、特异性检测、退火温度及引物浓度优化、方法检出限、方法再现性测试和加工品测试等试验,分别建立了普通PCR定性检测方法、实时荧光定量PCR方法检测方法和二重微滴式数字PCR检测方法。主要研究结果如下:(1)建立了转基因抗虫水稻的普通PCR定性检测方法:试验最终优选的引物组合:上游引物为5’-F4:5’-ATCTGTTTACTCGTCAAGTGTCATCTC-3’,下游引物5’-R1:5’-GCCATGGATTACATATGGCAAGA-3’;最适宜的退火温度为56℃;引物浓度为0.6μmol/L;检测限:不低于0.05 ng的抗虫水稻基因组;方法再现性好,能够检出经高温处理含有1%阳性成分的加工品。(2)建立了转基因抗虫水稻的实时荧光定量PCR方法检测体系:试验最终优选的引物及探针组合为:上游引物5’-QF1:CGACGTAGACGACTC,下游引物5’-QR3:ACGACATATAGGCAAGA,探针5’-QP1:AGCCACTGCGGCTTGATCAA;最适宜的引物和探针浓度分别为1.0μmol/L和0.5μmol/L;标准曲线的相关系数和扩增效率符合我国转基因检测方法标准的要求;能够检测不低于0.025 ng的转基因抗虫水稻基因组DNA;方法再现性好,能够检出经高温处理含有1%阳性成分的加工品。(3)建立了转基因抗虫水稻的二重微滴式数字PCR检测方法:在实时荧光PCR试验优化筛选的引物及探针基础上,通过优化反应体系及反应程序、稳定性试验、特异性试验、引物和探针浓度的优化、退火温度的优化以及定量线性范围范围和LOQ验证的一系列试验,确定最佳引物和探针浓度分别为400n M和200n M;60.4℃为最适宜的退火温度;抗虫转基因水稻特异性序列的定量线性范围在42.8~17000拷贝之间,可定量到为0.05ng的样品;水稻内源基因PLD定量线性范围在26.4~36133拷贝之间,可定量到DNA用量为0.01ng的样品。
【学位授予单位】:天津农学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S511;Q943.2

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【参考文献】
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